# 通过GWAS技术探寻Dnmt1基因在不明原因流产中的潜在突变点
## 一、研究设计
1. **样本收集**
- **病例组**:不明原因复发性流产(≥2次)患者,排除已知解剖、内分泌、感染等因素
- **对照组**:正常生育史的健康女性
- **样本量**:建议每组≥1000例(需进行统计效力计算)
2. **基因分型**
- 使用全基因组SNP芯片(如Illumina Global Screening Array)
- 重点注释Dnmt1基因区域(chr19:10,274,939-10,374,065,hg38)
- 补充靶向测序:对Dnmt1外显子/调控区深度测序(≥30×)
## 二、数据分析流程
mermaid
graph TD
A[原始数据质控] --> B[SNP筛选]
B --> C[群体分层校正]
C --> D[关联分析]
D --> E[多重检验校正]
E --> F[显著位点筛选]
1. **数据质控**
- 个体过滤:call rate <98%、性别不符、亲缘关系近
- SNP过滤:MAF <1%、HWE p<1e-6、call rate <95%
2. **关联分析**
- 采用PLINK进行logistic回归分析
- 协变量调整:年龄、BMI、孕次、前3个主成分
- 显著性阈值:全基因组5e-8,基因区域1e-5(需Bonferroni校正)
## 三、Dnmt1特异性分析
| 分析维度 | 具体方法 |
|----------------|----------------------------------|
| 错义突变 | PolyPhen-2/SIFT功能预测 |
| 调控元件 | 结合ENCODE/H3K4me3等表观数据 |
| 单倍型分析 | Haploview构建LD block |
| 表达QTL分析 | 整合GTEx数据库中子宫/胎盘eQTL数据 |
## 四、功能验证
1. **体外实验**
- 构建Dnmt1突变质粒(如p.C122Y)
- 转染滋养层细胞(JEG-3)观察:
- 甲基转移酶活性(ELISA)
- 基因组整体甲基化水平(LC-MS/MS)
2. **动物模型**
- 构建Dnmt1条件敲除小鼠
- 观察胚胎吸收率、胎盘血管生成情况
## 五、注意事项
1. 需通过Sanger测序验证候选突变
2. 考虑X染色体失逃对女性样本的影响
3. 建议联合检测DNMT1蛋白表达(IHC/WB)
4. 需排除母体-胎儿HLA相容性等混杂因素