# 阳性过表达拟南芥引物设计指南
## 一、设计原则
1. **目标基因特异性**
- 选择外源基因或过表达标签(如35S启动子、NOS终止子)的保守序列
- 避免与内源拟南芥基因组发生交叉反应
2. **载体兼容性**
- 若使用载体系统,需包含载体骨架特异序列(如T-DNA边界序列)
- 结合筛选标记基因(如Bar、Hygromycin抗性基因)
## 二、引物类型
| 引物对 | 用途 | 设计要点 |
|--------|------|----------|
| 基因特异引物 | 检测目标基因 | 跨内含子设计,覆盖外源基因全长 |
| 载体特异引物 | 确认载体整合 | 靶向T-DNA边界或启动子/终止子序列 |
| 双引物组合 | 过表达验证 | 载体序列+基因特异序列组合 |
## 三、关键参数
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1. 长度:18-25 bp
2. Tm值:55-65℃(上下游差值≤2℃)
3. GC含量:40-60%
4. 避免发夹结构(ΔG > -3 kcal/mol)
5. 3'端避免连续3个G/C
## 四、设计流程
1. 获取目标基因序列(NCBI GeneBank)
2. 比对拟南芥基因组(T普通用户R数据库)排除同源序列
3. 使用Primer-BLAST验证特异性
4. 选择跨外显子接合位点(避免基因组DNA污染干扰)
## 五、验证方案
- **阳性对照**:过表达质粒DNA
- **阴性对照**:野生型拟南芥DNA
- 预期产物:单一明亮条带(需通过测序确认)
## 六、常用工具
1. [Primer3](https://primer3.ut.ee/) 基础设计工具
2. [OligoCalc](http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) 理化性质分析
3. [SnapGene](https://www.snapgene.com/) 载体可视化设计
> **注意**:建议同时设计载体边界引物(如LB/RB引物)用于T-DNA插入验证,并配合抗生素筛选标记引物使用。